goto top
Trở về đầu trang
CAPTCHA
Mã bảo mật để ngăn chặn thư rác
Image CAPTCHA
Vui lòng nhập các ký tự bên trái để chống spam
  Liên hệ
NAVETCO NAVETCO

Nghiên cứu

Ảnh Hưởng của Interferon Alpha đối với Virut gây hội chứng rối loạn Sinh Sản và Hô Hấp

Cập nhật Thứ 2, 07.04.2014

I. Đặt vấn đề 

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở heo, xẩy ra với các đặc điểm rối loạn sinh sản ở heo nái và biểu hiện bệnh lý ở đường hô hấp, đặc biệt nặng ở heo bú sữa.

Năm 2006, xuất hiện dịch PRRS tại 10 tỉnh ở Trung Quốc, với hơn 2 triệu heo bị bệnh và khoảng 4  trăm ngàn heo chết và nguyên nhân được xác định là do virut PRRS  thể độc lực cao, typ 2 (Tian et al, 2007). Năm 2007, dịch bệnh PRRS với những diễn biến và bệnh lý giống như xẩy ra  ở Trung Quốc đã xuất hiện  ở Việt Nam  tại Tỉnh Hải Dương, sau đó  bệnh  lây lan rất  nhanh, gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo Việt Nam với hàng trăm ngàn heo nuôi bị bệnh, chết và tiêu hủy.  

Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và sản sinh interferron alpha (IFN-α) khi heo nhiễm virut PRRS là không xẩy ra hoặc rất yếu (Michael P, 2004), điều này dẫn đến hạn chế khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, bao gồm miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào.

IFN là một nhóm các protein được sản xuất bởi các tế bào của hệ miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virut, vi khuẩn, ký sinh trùng..vv, và  chỉ được sản sinh khi có mặt các chất sinh Interferon (interreronogen). Cơ chế họat động của IFN được  sản sinh trong cơ thể hay khi được đưa vào cơ thể để điều trị đều giống nhau, với chức năng cơ bản là kích thích hệ miễn dịch. Dưới tác động của IFN sẽ tạo ra một số sản phẩm, những sản phẩm này sẽ  làm tăng quá trình trình diện kháng nguyên đối với  tế bào đích và họat động chống lại virut  trong tế bào. Kết hợp các họat động này sẽ hạn chế sự nhân lên của virut, cũng như làm tăng quá trình đào thải các tế bào nhiễm bởi hệ thống miễn dịch. Tiêm IFN alpha/beta làm tăng cả đáp ứng kháng thể và tế bào T chống lại kháng nguyên hòa tan trong cơ thể động vật(Agnes et al, 2006). 

Hiện nay interferon đã được ứng dụng rộng rãi để điều trị bệnh viêm gan siêu vi C, B cho người (Charles E, 2001) và gia súc (dẫn theo Joseph et al, 2005). Người ta nhận ra rằng IFN α/β có ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch chủ động (Agnes et al, 2006) và IFN α hoạt động như là một chất bổ trợ miễn dịch khi tiêm kết hợp với vacxin cúm (Tovey et al, 2006), vacxin lở mồm long móng (Gong Cheng et al, 2007).

Nhằm có thêm thông tin về vai trò của IFN trong phòng chống bệnh truyền nhiễm, bài báo  này  xin trình bày kết quả  nghiên cứu  ảnh hưởng ức chế  của IFN α đối với  virut  gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp và tác dụng của nó khi tiêm kết hợp với vacxin vô hoạt PRRS. 

II. Vật liệu và phương pháp thí nghiệm 

2.1. Nguyên vật liệu thí nghiệm 
  • Giống virut PRRS 
    • Chủng virut PRRS đai diên cho hai dong Châu Âu và Bắc Mỹ do AAHL (Australian Animal Health Laboratory) cung cấp. 
    • Các chủng virut PRRS phân lập từ các địa phương Tiền Giang; Bình Dương; Long An; Đồng Nai; Sóc Trăng; Đồng Tháp; Củ Chi. NAVET/BG/PVR8; NAVET/TG/PVR18; NAVET/TG/PVR69; NAVET/BD/PVR1;  NAVET/LA/PVR6;  NAVET/ĐN/PVR1;  NAVET/ST/PVR10; NAVET/ĐT/PVR1; NAVET/CC/PVR2  
  • Dòng tế bào: Dòng tế bào MARC-145 do AAHL cung cấp.   
  • Môi trương nuôi cấy tế bào EMEM (Minimum Essential Medium with Earle’s salts), Invitrogen (Mỹ);  Huyêt thanh bao  thai bê (Fetal bovine serum  -  FBS),  Invitrogen (Mỹ);  Lactalbumin hydrolysate (LAH) 25%,  Oxoid (Anh); Sodium pyruvate 100 mM,  Invitrogen (Mỹ);  L  – Glutamine 200 mM của hãng Invitrogen (Mỹ);  N  –  2  –  Hydroxyethylpiperazine  –  N  –  2  – ethanesulphonic acid (HEPES) 1 M, VWR Scientific, Inc. (Mỹ);  Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3), Merk (Mỹ). 
  • Bộ kit ELISA LSIVET SUIS PRRS A/S của hãng LSI  (Pháp) được sử dụng phát hiện kháng thể kháng virut PRRS; 
  • Động vật thí nghiệm: Heo thí nghiệm 35 ngày tuổi , khỏe mạnh, không có kháng thể kháng virut PRRS và kháng nguyên virut PRRS được kiểm tra bằng phương pháp ELISA và RT - PCR. 
  • Vacxin PRRS vô hoạt do Công ty CAHIC, Trung Quốc. 
  • Navet - Interferon (1 MUI/ml) là sản phẩm của công ty Công nghệ sinh học dược NANOGEN và Công ty NAVETCO.
2.2. Phương pháp thí nghiệm 

2.2.1  Xác định nồng độ IFN-α ức chế sự phát triên cua virut PRRS trong in vivo. 

Chuẩn bị đĩa nhựa 96 giếng với tế bào MARC-145. Pha IFN-α thành các nồng độ khác nhau: 10.000 IU/ml; 7.500 IU/ml; 5.000 IU/ml; 2.500 IU/ml; và 1.250 IU/ml. Cho vào mỗi giếng 150 μl tương ứng với các nồng độ  IFN-α khác nhau. Nuôi  tế bào trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.  Sau 24 giờ  nuôi cấy  cho vào mỗi giếng 100 μl  huyễn dịch  virut  PRRS  nồng độ  100 TCID50/ml và tiếp tục nuôi cấy ở 37oC, 5% CO2. Tế bào được kiểm tra hàng ngày, thời gian 7 ngày. Quan sát CPE của tế bào ở các nồng độ  IFN và so sánh với đối chứng virut, đối chứng IFN và đối chứng tế bào. 

Để kiểm tra hiệu giá virut PRRS khi nuôi cấy trên tế bào MARC-145 có sử  lý với các nồng độ IFN, chúng tối tiến hành nuôi tế bào MARC-145 trong chai T25 và phương pháp được tiến hành giống như miêu tả ở  trên với 3 nồng độ  IFN đã được dùng 5000UI/ml; 2500 UI/ml; 1250 UI/ml. Sau khi gây nhiễm  virut  với liều  100 TCID50/ml, các chai tế  bào được theo dõi hàng ngày và ở thời điểm 96 giờ, các chai tế bào thí nghiệm và đối chứng được thu hoạch và giữ ở -70oC.  Các chai tê bao sau đó đươc làm đông tan va tiến hành chuẩn độ trên đĩa nhựa 96 lỗ.  

2.2.2  Thí nghiệm xác định thời điểm xử lý tế bào MARC-145 với IFN  

Thí nghiệm thực hiện trên chai T25, với nồng độ IFN-α dùng là 5.000 UI/ml và liều gây nhiễm  virut  chứa  100 TCID50/ml. Các nhóm thí nghiệm bao gồm: Nhóm 1: đối chứng tế  bào (không nhiễm virut PRRS); Nhóm 2: đối chứng IFN-α, không nhiễm virut; Nhóm 3: tế bào được nhiễm virut PRRS với liều 100 TCID50/ml; Nhóm 4: thêm IFN-α vào thời điểm 24 giờ trước khi nhiễm virut PRRS; Nhóm 5: thêm IFN-α vào cùng thời điểm nhiễm virut PRRS; Nhóm 6: thêm IFN-α vào thời điểm 24 giờ sau khi nhiễm virut PRRS. 

2.2.3  Khảo śt t́c dụng của IFN-α tiêm kết hợp với vacxin PRRS vô hoạt trên heo.  

Heo 35 ngày tuổi khỏe mạnh, âm tính với kháng thể và kháng nguyên PRRS được chia làm 4 lô, mỗi lô 3 heo. Lô 1 tiêm vacxin PRRS vô hoạt, liều 2ml/con; Lô 2 tiêm vacxin kết hợp với IFN-α, liều 5000 IU/kg; Lô 3  tiêm IFN-α, liều 5000 IU/kg; Lô 4: lô đối chứng, không tiêm IFN-α và vacxin. Ở các thơi điêm  0, 7, 14, 21, 28 ngày sau tiêm  vacxin, IFN-α, heo được lấy máu kiêm tra đáp ứng kháng thê băng phương phap ELISA.   

III. Kết quả và thảo luận 

3.1. Kết quả thí nghiệm 

3.1.1.  Nồng độ IFN-α ức chế sự nhân lên của virut PRRS 

Sử dụng các nồng độ IFN-α khác nhau để xử lý tế bào MARC -145 trước khi gây nhiễm với các chủng virut PRRS. Theo dõi biểu hiện bệnh tích tế bào, kết quả trình bày ở bảng 1 . 

Kết quả  cho thấy tế  bào MARC-145  xử  lý IFN-α  ở  nồng độ  5000 UI/ml và cao hơn (7500 UI và 10000 UI/ml) đã được bảo vệ  khi gây nhiễm  virut  PRRS với  100 TCID50/ml. Ngược lại, bệnh tích tế bào đã xuất hiện (CPE) ở các chai tế bào được xử lý IFN ở các nồng độ thấp hơn 1250 và 2500UI/ml. Tuy nhiên quan sát mức độ gây bệnh tích tế bào giữa tế bào xử lý IFN ở nồng độ 1250 và 2500 UI/ml với tế bào không được xử lý IFN cho thấy có sự khác nhau rõ rệt, mức độ có bệnh tích tế bào ở tế bào có xử lý IFN khỏang 15 -20% so với 70 – 80% ở  tế bào không xử lý (đối chứng virut, bảng 1), trong khi đó lô đối chứng tế bào và đối chứng IFN tế bào vẫn phát triển bình thường (Hình 1) 

Để kiểm tra mức độ ức chế virut PRRS của IFN, chúng tôi tiến chuẩn độ huyễn dịch tế bào nhiễm virut sau khi  đã xử lý IFN-α ở các nồng độ khác nhau. (bảng 2)  

Kết quả chuẩn độ chỉ ra rằng IFN-α đã có khả năng hạn chế sự phát triển  của virut PRRS ở nồng độ  1.250 IU/ml với hiệu giá virut biến động từ 103,0 – 104,5 TCID50/ml, nồng độ 2.500 IU/ml từ 102,5 – 104,0 TCID50/ml và nồng độ 5.000 IU/ml là nhỏ hơn 101,0TCID50/ml, trong khi đó các tế bào đối chứng không xử lý IFN-α, hiệu giá virut đạt từ 105,5 – 106,0 TCID50/ml.  

3.1.2. Ảnh hưởng thời điểm tế bào được xử lý IFN đến sự ức chế ph́t triển của virut PRRS. 

Thí nghi ệm  dùng  5  chủng  virut  PRRS  phân lâp  NAVET/BG/PVR8, NAVET/TG/PVR18, NAVET/BD/PVR1, NAVET/ĐN/PVR2, NAVET/ĐT/PVR1  và liều IFN sử  dụng  là 5000  UI/ml. (bảng 3) 

Kết quả bảng 3 ghi nhận không có sự khác nhau giữa tế bào xử lý IFN trước và cùng lúc với nhiễm virut PRRS, với hiệu giá virut được xác định nhỏ hơn 101 TCID50/ml, trong khi tế bào được xử  lý với IFN sau 24 giờ gây nhiễm, hiệu giá virut có cao hơn so với  tế bào được xử  lý trước hoặc cùng một lúc với nhiễm virut PRRS.Tuy nhiên khi so sánh hiệu giá virut thu được ở lô tế bào xử lý IFN sau gây nhiễm 24 giờ với lô đối chứng tế bào không xử lý IFN cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P< 0,0001 ( 102  –  103  TCID50/ml so với 105,5  –  106TCID50/ml).  

3.1.3. Ảnh hưởng của IFN-α trong đ́p ứng miễn dịch khi tiêm kết hợp với vacxin 

Để nghiên cứu vai trò của IFN-α trong kích thích đáp ứng kháng thể khi tiêm cùng với vacxin PRRS vô hoạt, thí nghiệm đã được tiến hành trên 12 heo 35 ngày tuổi, chia làm 4 lô, mỗi lô gồm 3 heo, kết quả trình bày ở bảng 4. 

Kiểm tra đáp ứng kháng thể sau khi tiêm vacxin cho thấy heo ở các lô thí nghiệm đều cho kết quả ELISA âm tính khi kiểm tra ở ngày thứ 7 và 14. Tuy nhiên nhóm heo  tiêm vacxin kết hợp với IFN đã cho kết quả ELISA chuyển dương ở ngày 21 và 28, trong khi đó heo ở  lô chỉ tiêm vacxin PRRS (lô 1) và IFN (lô 3) đều cho kết quả ELISA âm tính .   

3.2. Thảo luận kết quả 

Như chúng ta đã biết phản ứng đầu tiên của đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu khi cơ thể nhiễm virut là sản sinh IFN-α. Tuy nhiên điều này lại không xẩy ra khi heo nhiễm virut PRRS. Qua thí nghiệm trên in vitro đã phát hiện tế bào sẽ không sản xuất IFN-α khi nhiễm virut PRRS, thậm trí virut PRRS ngăn chặn sản sinh  IFN-α khi tế bào được nhiễm với virut TGE, một tác nhân kích thích sản sinh IFN-α rất mạnh. 

Sự ức chế sản sinh IFN-α tạo điều kiện cho virut PRRS nhân lên mạnh trong cơ thể, cũng như làm giảm hiệu quả họat động chống nhiễm khuẩn của phản ứng miễn dịch không đặc hiệu và hậu quả đã làm tăng cơ hội nhiễm trùng thứ phát trong hội chứng PRRS. 

Khả năng ức chế virut phát triển và tăng cường phản ứng miễn dịch của IFN-α đã được nhiều tác giả thông báo. Việc sản sinh IFN-α khi cơ thể nhiễm virut là yếu tố quyết định có liên quan  thuận đến khả năng chống lại quá trình nhiễm trùng ở động vật. Albina et al, 1998 chứng minh rằng IFN-α ức chế sự phát triển của virut PRRS dòng châu âu trên in vitro, và rằng nồng độ thấp của  IFN-α  có thể phát hiện trong huyết thanh của heo bệnh, nhưng không rõ vì lý do gì không phát hiện được trong dịch tiết của phổi.  

Nghiên cứu của chúng tôi chứng minh được vai trò của  IFN-α ức chế sự phát triển của các chủng virut PRRS thuộc các dòng khác nhau Châu Âu và Bắc Mỹ. Kết quả chỉ ra khi tế bào MARC-145 được xử lý IFN-α ở nồng độ 1250 UI/ml đã hạn chế được virut PRRS nhân lên, biểu hiện ở mức độ gây bệnh tích tế bào và hiệu giá virut đạt được. Ở nồng độ 5000 UI/ml, IFN-α đã ức chế hòan tòan khả năng gây bệnh tích tế bào và khi chuẩn độ virut  cho thấy đạt dưới 101TCID50/ml. Kết quả này cũng chứng tỏ IFN-α sử dụng trong thí nghiệm không có tính đặc hiệu loài. Về mặt này nhiều tác giả đã thông báo IFN-α có nguồn gốc từ người (Hu IFN-α) có thể ảnh hưởng lên các tế bào có nguồn gốc động vật và ngược lại (Joseph M. et al, 2005).  

Mặc dù IFN-α/β được cho là có vai tr̀ chính trong đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu với chức năng ức chế sự nhân lên của virut, nhưng IFN-α/β cũng  là một cytokine có  tác động hiệu quả đến đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và hoạt động giống như một chất bổ  trợ miễn dịch. Ảnh hưởng thuận giữa đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà hiệu quả của nó làm tăng khả năng ph̀ng chống bệnh truyền nhiễm ở động vật chính là hệ quả của việc có sản sinh  IFN-α hay không khi có sự kích thích của tác nhân sinh  IFN. Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu yếu trong hội chứng PRRS, trong đó có việc ức chế sản sinh IFN-α dẫn đến hệ quả phản ứng đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào yếu. Người ta thấy rằng khi tiêm IFN-α/β đã làm tăng cả đáp ứng kháng thể và đáp ứng tế bào lympho T chống lại kháng nguyên h̀a tan trong cơ thể (Le Bon, et al, 2001).  

Meier et al đã chứng minh việc tiêm phòng vacxin PRRS kết hợp với IL-12 hoặc IFN-α làm tăng đáp ứng đối với IFN-γ và như vậy khả năng sản xuất IFN type 1 trong phản ứng miễn dịch không đặc hiệu là yếu tố chính, mà điều này không xẩy ra hoặc yếu trong phản ứng chống lại virut PRRS.  

Thí nghiệm của chúng tôi cho thấy vai trò của IFN-α trong đáp ứng kháng thể chống virut PRRS khi tiêm vacxin kết hợp với IFN. Trong khi lô heo chỉ tiêm vacxin PRRS vô họat không phát hiện được kháng thể PRRS ở tất cả các thời gian theo dõi, thì heo ở lô tiêm vacxin kết hợp với  IFN-α đã phát hiện được kháng thể bằng phương pháp ELISA ở ngày thứ 21 sau khi tiêm vacxin. Vì heo ở  lô đối chứng không tiêm vacxin hay  chỉ  tiêm  IFN-α  cho kết quả ELISA âm tính, chứng tỏ không có sự xâm nhiễm và lưu hành của virut PRRS trong các lô thí nghiệm và điều này càng củng cố kháng thể kháng virut PRRS phát hiện bằng ELISA ở các heo lô 2 (bảng 4) là do tiêm phòng vacxin PRRS và IFN-α đã có vai tr̀ kích thích đáp ứng kháng thể. Điều này đã không xẩy ra ở lô heo chỉ tiêm vacxin PRRS (lô 1-bảng 4). Kết quả thí nghiệm của chúng tôi phù hợp với nhận xét Tovey et al (2006) khi cho rằng  IFN-α hoạt động như là một chất bổ  trợ miễn dịch mạnh khi tiêm kết hợp với vacxin cúm.  

Hiệu quả tiêm phòng vacxin PRRS vô hoạt kết hợp với IFN-α cũng được chứng minh khi tiến hành thử thách cường độc (số liệu không dẫn) và kết quả cho thấy có sự khác nhau rất rõ về mức độ trầm trọng của bệnh giữa các lô tiêm vacxin và lô heo tiêm vacxin kết hợp với IFN-α so với lô đối chứng  (heo không tiêm vacxin), đặc biệt heo ở các lô thí nghiệm đều có hiện tượng giảm trọng lượng (trung bình 0,5 kg/con ở lô tiêm vacxin và 2 kg/con ở lô đối chứng), trong khi lô heo được tiêm vacxin kết hợp với IFN-α vẫn phát triển bình thường, với mức tăng trọng trung bình 1,5kg/con.   

Thí nghiệm cũng chứng minh khi tiêm vacxin PRRS cho heo, đáp ứng kháng thể sau khi công xuất hiện rất nhanh và mạnh và có thể phát hiện được bằng kỹ  thuật ELISA ở ngày thứ 7 với hiệu giá kháng thể đạt được ở mức khá cao, mặc dù trước khi công ở những heo này không phát hiện được kháng thể (số liệu không dẫn). Hiện tượng này chứng tỏ việc tiêm vacxin PRRS vô họat đã có tác dụng làm tăng cường khả năng đáp ứng miễn dịch thứ phát thông qua cơ chế “trí nhớ miễn dịch” khi heo có cơ hội phơi nhiễm với virut PRRS sau khi đã được tiêm vacxin PRRS vô hoạt.  

Từ kết quả thu được có thể kết luận rằng IFN-α ức chế sự nhân lên của virut PRRS trên tế bào MARC-145 và khi tiêm IFN-α kết hợp với vacxin PRRS vô hoạt có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, làm gia tăng hiệu quả phòng trị bệnh rối loạn hô hấp và sinh sản trên heo. 

Trần Xuân Hạnh, Bùi Anh Thy, Kim Văn Phúc, Nguyễn Tăng Trường
(Trung tâm nghiên cứu thú y – NAVETCO)

 

Từ Khoá :

Đánh giá an tòan và hiệu lực của vacxin nhược độc đậu dê trong điều kiện sản xuất

Cập nhật Thứ 2, 07.04.2014

Vacxin nhược độc đậu dê đã được đánh giá về an toàn và hiệu lực trong điều kiện sản xuất. Kết quả chỉ ra rằng vacxin đều an toàn khi tiêm... Xem thêm